RESUMEN GENERAL DE TERAPIA GENICA
una presentacion en power point elaborada con algunos articulos de internet y referencias bibliograficas, que ayuda a la comprension de la terapia genica
HISTORIA DE LA TERAPIA GENICA
Desde el descubrimiento de las enzimas de restricción en el año de 1.970 por Arber y Hamilton se sentaron las bases para transferir genes entre diferentes células u organismos, inclusive pertenecientes a diferentes especies. En 1.978 se realizó la primera hormona recombinante insertando el gen de la insulina en una bacteria E. coli. De allí en adelante se afianzaron los conocimientos necesarios para transferir genes a células humanas con el fin de alterar el fenotipo patológico y generar una nueva forma terapéutica. La primera transferencia se realizó en el año de 1.989 en un paciente con una inmunodeficiencia. Aunque no se encontraron efectos clínicos se explicitó que tampoco había efectos deletéreos como muchos apocalípticamente habían pronosticado. En 1.990 se trató con terapia génica un paciente que padecía de la deficiencia de la enzima adenosina-deaminasa presentando infecciones bacterianas a repetición. Aunque la mejoría fue temporal, con este ensayo se comprobó que la terapia génica tenía posibilidades terapéuticas reales.
En Enero de 1989 los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos aprobaban el protocolo clínico presentado por los Dres. Anderson, Blaese y Rosenberg para insertar un gen extraño en las células del sistema inmunitario de pacientes de cáncer. Aunque tal protocolo no representaba una terapia génica per se, sin embargo las técnicas utilizadas eran idénticas a las requeridas para la TG verdadera. En palabras del Dr. Anderson, ello significaba realmente que la tecnología para insertar genes en humanos había llegado. De hecho, poco después, en Septiembre de 1990, se aprobaba el primer ensayo clínico de auténtica terapia génica a los Dres. Blaese, Anderson y colaboradores: se trataba de introducir el gen que codifica para la enzima adenosin desaminasa (ADA) en niños que padecen una inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Son los llamados “niños burbuja”. Poco tiempo después (Febrero 1991) se autorizó también el mismo tipo de TG en Italia (Dr. Bordignon y colabores en el Hospital San Raffaele de Milán). En 1995 ambos grupos de investigación publicaban los resultados de su experimentación clínica poniendo de manifiesto la eficacia de la técnica de TG ex vivo en los “niños burbuja”.
En la actualidad, se sigue investigando y desarrollando las distintas tecnicas de Terapia Génica.
Compañías farmacéuticas y centros de investigación de Europa, Estados Unidos y Japón ya han apostado a esta nueva posibilidad. De hecho, a principios de los 90 se incluía a grandes compañías como Sandoz, Ciba Geigy y Rhone Poulenc Rorer. En 1992, el mercado correspondiente fue estimado en 1,2 billones de dólares. Estimaciones más recientes alcanzan los 45 billones de dólares para el año 2015
INFOGRAFIA
http://www.terapiagenica.es/wordpress/2008/01/27/historia-de-la-terapia-genica/
CANCER DE PROSTATA Y TERAPIA GENICA EN COLOMBIA
En Colombia el cáncer de próstata es la segunda causa de muerte de origen oncológico en varones. Las terapiasconvencionales no han logrado reducir la mortalidad de manera significativa, por lo cual se requiere la búsqueda denuevasterapias basadas en técnicas de biología molecular, siendo la terapia génica una de las alterativas terapéuticas másprometedoras. Debido a que hasta el momento no se ha realizado esta técnica en Colombia, en este artículo se discuten lasprincipales características de la terapia génica como son, los
tipos de vectores y moléculas blanco, correlacionadas con las características moleculares de la enfermedad; adicionalmentese presenta una revisión de los diferentes protocolos de terapia génica contra el cáncer de próstata realizados en el mundo,hasta enero del 2004, como punto de partida para la aplicación de terapia génica en el país.
Lea el articulo completo en: http://www.urologiacolombiana.com/revistas/marzo-2004/002.htm
PARKINSON Y TERAPIA GENICA
No es contagiosa, no es mortal, no produce envejecimiento ni demencia y en algunos casos ni siquiera produce temblores, pero cuando la enfermedad de Parkinson hace su aparición, la vida cambia para siempre (*).
Aunque ya hay respuestas a inquietudes y mitos que durante muchos años rondaron esta afección a las estructuras del cerebro encargadas del control y la coordinación del cuerpo, los científicos siguen investigando para ver si encuentran un método radical que permita que un paciente se recupere.
En septiembre del año pasado, investigadores de la Universidad de Manchester, en el Reino Unido, y del Centro Médico Cedars-Sinai, en Estados Unidos, publicaron un estudio en la revista especializada ’Molecular Therapy’ acerca de la investigación del Instituto para la Investigación en Terapia Genética (Gtri), en el que se abría una esperanza en torno al Parkinson y su progreso neuronal.
Dicho instituto-laboratorio, auspiciado por la Escuela de Medicina de la Universidad de Harvard, es dirigido por los científicos Pedro Lowenstein y Maria Castro, y su principal investigador es el biólogo colombiano Andrés Hurtado-Lorenzo, quien habló con eltiempo.com
Los resultados obtenidos por el trabajo de Hurtado-Lorenzo en el Gtri, que han tenido eco en publicaciones científicas como NewScientist, resultan sorprendentes: al experimentar con ratones, logró reducir en un 40 por ciento la presencia de neuronas afectadas.
Lo que se afecta con el Parkinson
¿Qué ocurre en el cerebro cuando se presenta esta enfermedad? las neuronas que se encuentran en la región del cerebro llamada ’substantia nigra’ dejan de producir la dopamina, una sustancia química reguladora en el cerebro.
Hasta el momento, los tratamientos existentes contra el Parkinson son varios tipos de drogas que suplen la dopamina faltante en el cerebro pero otras neuronas pueden seguir muriendo.
La función de la dopamina determina el control nervioso de los músculos del cuerpo, así que, si la dopamina funciona irregularmente, genera reacciones como el temblor, característica del Parkinson.
¿En qué consiste la terapia genética investigada?
El proceso que realiza Hurtado-Lorenzo consiste en el uso de ADN como si fuera un medicamento, a través de la siembra de dos proteínas en las neuronas afectadas.
Según explicó el biólogo colombiano, quien respondió las preguntas vía correo electrónico, se requiere de un proceso que no sólo reemplace la dopamina faltante, sino que "detenga la muerte de las neuronas dopaminérgicas".
Es así como dichas células tendrían que asimilar un nuevo material genético, identificado como dos proteínas llamadas Shh y Gli-1.
Sin embargo, la célula no recibiría ese material ’por las buenas’, así que hay un curioso método para forzar la asimilación: infectarlas con un virus ficticio.
Este adenovirus es manipulado en el laboratorio para que no sea peligroso, técnica que actualmente analizan diferentes laboratorios, entre ellos el Grupo de Neurociencias del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia.
El médico Bruno Benítez, miembro del mencionado grupo que fue consultado por eltiempo.com, señaló que "este es un avance para la comunidad científica colombiana que complementa los diferentes esfuerzos que hemos venido realizando en el país enfocados a la identificación de factores genéticos y moleculares involucrados en la enfermedad de Parkinson en nuestra población colombiana".
Sobre posibles riesgos de la manipulación del adenovirus transportados de las proteínas, Benítez dijo que el procedimiento "es altamente eficiente, pues logra expresar de manera estable, temporal y espacialmente controlada altos niveles de la proteína deseada".
Confirmó Benítez que "en este caso introducen de manera novedosa proteínas que cambian la expresión de algunos genes y ejercen efectos específicos sobre la supervivencia de las neuronas que se van perdiendo en la enfermedad de Parkinson".
Qué hace el virus modificado
El adenovirus engaña a las células al llegar al cerebro con la agresividad de una nueva enfermedad e inocula las neuronas con las proteínas benéficas.
Hurtado-Lorenzo asegura que "este trabajo representa la primera demostración que después de una sola administración en el cerebro de los genes Shh y Gli-1, es posible evitar la muerte de las neuronas".
De comprobarse en humanos un resultado positivo de esta primera etapa investigativa con ratas, se podrían desarrollar nuevos tratamientos que, plantea Hurtado-Lorenzo, se podrían aplicar tanto para prevenir el origen del Parkinson como para reducirlo en enfermos.
El biólogo comenta que "esto es lo que hemos logrado en un modelo animal de la enfermedad. Sin embargo -añade- aun existen varias etapas que superar antes que este tipo de tratamiento sea real a corto plazo en humanos. Uno de los aspectos mas importantes para superar es la creación de vectores virales más seguros para la administración de genes neuroprotectores en humanos, aspecto en el que varios grupos de investigación están trabajando con resultados muy prometedores".
Acerca del futuro de esta investigación y los posibles tratamientos que genere, Hurtado-Lorenzo señala que "mantener vivas las neuronas que mueren en los pacientes con Parkinson sería la terapia ideal".
Los resultados propuestos por este científico colombiano, respaldado por la Universidad de Harvard, fueron destacados por la comunidad científica internacional pero es sólo una etapa previa en esta senda investigativa.
La intención de este artículo no es la de comprobar dichos resultados, sino destacar el trabajo de este científico colombiano en pro de la búsqueda de respuestas a una enfermedad tan inquietante como dramática.
Carlos Solano Franco
Redactor de Eltiempo.com
http://eltiempo.terra.com.co/salu/notisalud/ARTICULO-WEB-_NOTA_INTERIOR-1985881.html
TERAPIA GÉNICA CONTRA EL VIH
El VIH (Virus de Inmunodeficiencia Adquirida) es un virus de una solo hebra que presenta en cada extreno repeticiones terminales largas (LTR), y tres genes estructurales: gag, que codifica un precursor proteico, pol que codifica tres enzimas virales: proteasa, transcriptasa reversa e integrasa; y env, que codifica glicoproteínas de membrana. El VIH es también un retrovirus complejo que, además de lo genes estructurales, expresa seis genes que regulan la expresión viral.
El ciclo celular de VIH comienza con la unión de una proteína viral gp 120 al receptor CD4 en la membrana de los linfocitos T. Después de la entrada del virus, la transcriptasa reversa asociada al virus, transcribe el ARN genómico viral y produce ADN viral de doble hebra, el cual es transportado hacia el nucleó. La expresión de los genes virales es iniciada por el promotor del VIH y es aumentada por factores de transcripción celular, los cuales también estas asociados la a los procesos de activación de lo linfocitos T. Así cada vez que los linfocitos T infectados se activan, la transcripción del virus también es activada. Lo genes reguladores tat y rev son los primeros en ser expresados, y son necesarios para modular la síntesis de ARN mensajero. La proteína Tat aumenta la transcripción del genoma viral en 10000 veces. La proteína Rev es esencial para la expresión de proteínas estructurales necesarias en las etapas finales de la replicación viral: el ensamblaje, la maduración y la salida de partículas virales. [1]
A continuación se enumeran diferentes estrategias aplicadas en los ensayos clínicos realizados en terapia génica por la infección de VIH: [2]
- Transferir un gen del virus VIH
- Introducir genes de inhibidores celulares de la replicación vírica en líneas celulares de linfocitos T y monocitos, con la consiguiente inhibición de la producción de VIH
- Transferir genes de proteínas mutantes del VIH
- Secuestrar proteínas víricas reguladores mediante señuelos de ARN
- Oligonucleótidos antisentido
- Manejo de ribozimas, que son ARN con propiedades catalíticas.
- Inty5oduccion en las células diana de genes que codifican anticuerpos de cadena única frente a proteínas del VIH.
Actualmente los estudios que se realizan para el control de esta enfermedad van dirigidas al manejo de células madre y de linfocitos CD4+, en los cuales se introduzca un gen que los haga resistentes al VIH, de tal manera que a medida que estas células se reproducen las nuevas serian resistentes al VIH prosperarían y reemplazarían a las infectadas.
En febrero de este año (2009) la revista Nature Medicine publicó los resultados de la segunda fase de tratamiento a 74 pacientes con VIH, concluyendo que el procedimiento utilizado es seguro y activo. Inicialmente en esta investigación, se tomaron linfocitos CD4 de pacientes seropositivos a los cuales se les añadió la enzima OZ1 que previene la replicación del VIH atacando dos proteínas claves del virus. A un grupo de pacientes se les aplico un placebo, mientras que a otro se les aplicaron los CD4 modificadas, los resultados a las 100 semanas confirmaron que entre los dos grupos de paciente existía una diferencia significativa en el conteo de CD4 (células que son destruidas por VIH), los inyectados con cd4 con la enzima OZ1 presentaron mayor cantidad de CD4, ahora el reto es pasar a una fase 3 que permita constituir esta estrategia en la terapia clínica.
Trabajos citados
[1] Project inform. (2005). Terapia inmunológica: terapia genica para el VIH. San Francisco: Project inform.
[2] Ronchera, C., & González, J. (2004). Terapia Génica.
ENFERMEDADES TRATADAS MEDIANTE TERAPIA GÉNICA
Durante las últimas tres décadas una proporción creciente de investigación genética está dedicada a estudios moleculares en medicina. Esto produjo importantes cambios en el entendimiento de la fisiopatología de diversas enfermedades genéticas. Aunque muchos descubrimientos fueron aplicados a las técnicas diagnósticas, la utilización de técnicas moleculares en el tratamiento de enfermedades genéticas es lógico y natural. La terapia génica consiste en la utilización de ácidos nucleicos con fines terapéuticos. Aunque esta técnica es muy joven, ya que el primer paciente tratado fue en 1990, presenta un futuro muy prometedor. En los primeros 9 años, 396 protocolos clínicos, en más de 3.000 pacientes de 22 países fueron ensayados.
La terapia génica (TG) es la parte de la terapéutica que utiliza material genético en el tratamiento de enfermedades; intenta modular la función celular, pudiendo corregir la deficiencia causada por la pérdida o alteración de un gen al modificar la expresión de proteínas. Así, secuencias codificadoras de proteínas, sondas anti-sentido, ADN triples y ribozomas pueden ser considerados los fármacos de la TG. (JUANA ROZALÉN, 2003).
La TG requiere, en primer lugar, la identificación del gen o grupo de genes que causan la alteración a subsanar, su aislamiento y clonación. Es en este contexto donde emerge con luz propia una de las mayores aventuras de la biología humana, el proyecto genoma humano (P.G.H), entendiendo por genoma humano a la totalidad de la información genética contenida en las células humanas, tanto en el núcleo como en las mitocondrias.
Aunque no conocemos con certeza el número exacto de genes humanos, es, sin duda, inferior a los 100.000 que se esperaban y, todavía en las aproximaciones realizadas por los investigadores, resultan cifras bastantes variables.
La última aproximación realizada a través del programa bioinformática First Exon Finder, da una cifra de unos 56.000 genes. Sin embargo, la cartografía y secuenciación del genoma hunano tan sólo nos va a ofrecer una cantidad masiva de información. Será necesario un tiempo de interpretación y traducción de la secuencia de ADN a su función biológica, lo que hace que su conocimiento constituya tan sólo el inicio, y no el final, de un camino denominado proteonómica.
La variación genética se originan por dos causas: las mutaciones cromosomitas y las mutaciones génicas o puntuales. Entre las primeras también llamadas aberraciones cromosómicas, se encuentra la duplicación, la delección y la reordenación de segmentos de cromosomas.
Las mutaciones génicas se producen por un cambio en la información química en el DNA, que en conjunto se denomina el genotipo de un organismo. Tal cambio puede ser una sustitución, duplicación o delección de nucleótidos, que componen esta información química. Las formas alternativas de un gen que se produce como consecuencia de la mutación, se denominan alelos. Frecuentemente, aunque no siempre, la variación genética da lugar al cambio de alguna característica del organismo, denominada como fenotipo. Una vez que forma parte del repertorio genético de un organismo, tal variante puede extenderse por toca la población mediante diversos mecanismos reproductivos. (Rómulo Aycachi, 2004)
Aunque su aplicación en seres humanos es fuente de gran controversia debido a los problemas éticos que supone, para el gremio medico es un gran avance para el tratamiento de enfermedades y mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes.
Describiremos algunas de las aplicaciones que se han realizado con la TG observando si es in vivo o ex vivo.
1 Hemofilia
La TG está resultando también eficaz en casos de hemofilia «A» y «B» donde se encuentran alterados los factores coagulantes VIII y IX, respectivamente. En ellas se han realizado aproximaciones utilizando el transgén de estos factores y vectores retroviales, adenovirus, virus adenoasociados y ADN desnudo administrados por vías comunes como la subcutánea, intramuscular, intrahepática, intraperitoneal, o intravenosa.
Los vectores actúan como un liberador de los factores a las células musculares del paciente, donde producirán continuamente este factor. Valores equilibrados de éstos en el flujo sanguíneo reducirán sustancialmente los episodios de hemorragias espontáneas y la necesaria infusión de estas proteínas en los pacientes de este tipo de hemofilia.
2 Fibrosis quística
En la fibrosis quística se ha observado un defecto en el gen que codifica para el canal de cloro conocido como CFTR, que resulta en un transporte anormal de electrólitos en las glándulas exocrinas y conduce a una enfermedad crónica obstructora de los pulmones, insuficiencia pancreática exocrina y aunento de la cantidad de electrólitos en el sudor. Utilizando como transgén el gen de CFTR y las células del epitelio del tracto respiratorio, se han realizado estudios utilizando liposomas y adenovirus como vectores. Los riesgos de toxicidad parecen descartados en los primeros intentos y basta algo tan sencillo como un inhalador para conseguir la expresión del gen y aliviar en un 30% los síntomas de la enfermedad.
3 Distrofia muscular Duchenne
En un avance significativo hacia un tratamiento para la distrofia muscular de Duchenne (DMD), investigadores han usado TG para proteger músculos respiratorios vitales en ratones con la enfermedad, debido a que la mayor causa de muerte en la DMD es el deterioro del diafragma. La nueva investigación ha demostrado por primera vez cómo el diafragma puede ser rescatado por medio de la inyección intravenosa con el gen de la distrofina, que es defectuoso en las personas con DMD. Después del tratamiento, el músculo del diafragma del ratón mostró una expresión estable del gen de la distrofina durante seis meses.
4 Alteraciones hepáticas
A pesar de los problemas técnicos, existen protocolos clínicos aprobados para la transferencia ex vivo de genes al hígado, para el tratamiento de la insuficiencia hepática aguda e hipercolesterolemia familiar. Los experimentos con ratones transgénicos, bioquímica y fenotípicamente modificados han permitido evaluar la eficacia terapéutica de la transferencia génica somática de vectores adenovirales de la ornitina transcarbamilasa (OTC), beta-galactosidasa y alfa1-antitripsina humana. Una de las vías para restituir la funcionalidad del hígado cirrótico se enfoca en la degradación del exceso de acunulación de proteínas de la matriz extracelular, principalmente colágena tipo I en el parénquima hepático. La metaloproteasa de matriz-8 o colagenasa de neutrófilos de hunano es una buena candidata para ser sobre expresada. Otra aproximación, en hígados cirróticos, la constituye el gen del activador del plasminógeno urocinasa hunano modificado. Su inserción mediante un vector adenoviral induce la degradación del exceso de matriz extracelular y estimula la proliferación de hepatocitos, logrando un rápido restablecimiento de la funcionalidad del hígado.
5 Diabetes
La TG mantiene abiertas dos líneas de investigación en pacientes con diabetes tipo 1, caracterizada por una pérdida completa de las células betapancreáticas. Mientras la primera se basa en la modificación de la respuesta anómala del sistema inmunitario, la segunda intenta aumentar el número de células capaces de secretar insulina.
Entre las vías de actuación sobre la respuesta autoinmunitaria destacan:
– Inhibición de moléculas implicadas en el desarrollo de la diabetes tipo 1 como interleucina 1beta, factor de necrosis Tumoral alfa, interferón gamma, interleucina 6 y óxido nítrico.
– Estimular la expresión de interleucina 4 con el fin de prevenir el proceso de inflamación previo a la destrucción de las células beta.
– Inhibición de la interacción de moléculas Fas/Fas-L.
– Producción local, en células beta genéticamente modificadas, de moléculas anti-CD40-ligando, una proteína que desempeña un papel clave en la activación de los linfocitos T. Con el fin de aumentar el número de células beta, la TG ha centrado sus esfuerzos en generar células no-beta capaces de secretar insulina en respuesta a las concentraciones de glucosa. El tipo celular donde se han obtenido resultados más interesantes y que há generado mayores expectativas es el hepatocito. Los hepatocitos presentan la capacidad de captar la concentración extracelular de glucosa, ya que comparten con las células beta algunos de los componentes naturales del sistema de detección de glucosa, como la glucocinasa y GLUT-2. Los hepatocitos modificados son capaces de producir insulina con la actividad biológica y funcional similar a la de la molécula producida por el páncreas. No obstante, debido a que las células del hígado presentan diferente sensibilidad a la glucosa que el páncreas, las cinéticas (los ascensos y descensos) de producción de la insulina obtenida son muy diferentes a las de la insulina nativa producida por el páncreas, y el control de la glucosa en sangre no resulta óptimo.
La introducción del gen PDX-1, implicado en las primeras fases de formación y desarrollo del páncreas, y en el control de la expresión del gen de la insulina en células beta maduras, ha resultado suficiente para que el hígado de los ratones produzca insulina, lo que ha permitido un descenso de las concentraciones de glucosa de los animales a los que se les había inducido la diabetes mediante el agente químico estreptozotocina.
6 Enfermedades neurodegenerativas
Se han realizado también aproximaciones de TG en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en humanos. En cultivos primarios de neuronas piramidales de hipocampo de rata se ha sobre-expresado la proteína calbindina D28K, obteniéndose altos rendimientos. Esta proteína es capaz de unirse al ion calcio modulando sus concentraciones citoplasmáticas. La sobre-expresión de esta proteína confirió protección a los cultivos frente a estímulos citotóxicos como el fragmento 25-35 del péptido betaamiloide. También se há analizado a pacientes en las primeras etapas de la enfermedad, con la implantación de células cutáneas a las que previamente se les ha introducido el gen del factor de crecimiento neurológico (NGF) que ha mostrado resultados positivos en el deterioro cerebral en monos viejos.
Otras patologías como la enfermedad de Parkinson, en la que la relación con los factores genéticos es menos clara, representan un mayor desafío. En esta enfermedad, la TG ha sido llamada el «tercer paso», tras la terapia sustitutiva con la levodopa y los implantes de células dopaminérgicas. Así, las células hiperactivas del núcleo subtalámico son consideradas como células diana para la inserción del gen de la descarboxilasa glutámica ácida (GAD), responsable de la producción del neurotransmisor inhibitorio GABA, obteniéndose como resultado un funcionamiento más normal de la actividad de la red cerebral. También se han realizado aproximaciones de TG ex vivo, con trasplantes de células capaces de producir dopamina o de secretar factores de crecimiento o neurotrofinas (BDNF, GDNF) que actúan como agentes neurotróficos, activando rutas de supervivencia celular en las neuronas afectadas. Utilizando un virus de inmunodeficiencia felino sobre un modelo animal de una enfermedad lisosomal humana, la enfermedad de Sly, con déficit de enzima betaglucuronidasa que cursa con deterioro neurológico progresivo, presentó, por primera vez en este tipo de investigaciones, no sólo la prevención del progreso neurológico, sino también la restauración de las capacidades previas mentales de los animales.
Como último ejemplo de las enfermedades neurodegenerativas en las que se han llevado a cabo diversas aproximaciones de TG, citaremos las ataxias, en las que se ha utilizado como vector un VIH atenuado capaz de alcanzar los ganglios dorsales medulares, una de las áreas más afectadas en la ataxia de Friedreich. Se ha planteado el uso de moléculas, como el factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-I), que retrasen la muerte celular observada, planteándose la posibilidad de la regeneración neuronal mediante el uso de células madre.
7 Ceguera
Se han realizado estudios en un tipo de ceguera total, acompañada de degeneración de la retina, que se relaciona con mutaciones en el gen RPE95. En modelos experimentales, la administración directa en la retina de un virus portador del gen funcional es capaz de impedir la degeneración y permite que la actividad eléctrica de esta estructura ocular sea comparable a la que se observa en animales sanos. Los resultados de este estudio constituyen el primer éxito para prevenir la ceguera en un mamífero y tienen una importancia adicional, si consideramos que las mutaciones del gen RPE95 se observan en el humano en la ceguera congénita conocida como amaurosis de Leber. Por otro lado, la manipulación genética de células de la córnea ex vivo puede ser, en el futuro, una solución frente a la incompatibilidad y el rechazo observado en algunos trasplantes de córnea. Hasta ahora, los experimentos realizados en animales han sido un éxito.
8 Sida
Se han realizado aproximaciones, tanto in vivo como ex vivo, en el sida, mediante el empleo de vectores retrovirales portadores de genes de la cápside o la envoltura del VIH, como la glicoproteína 120, siendo los linfocitos T las células diana. Los glóbulos blancos modificados reconocen las células infectadas por el VIH y las eliminan, tanto en las primeras etapas de la infección como al cabo de largos tratamientos antivirales. En los primeros ensayos clínicos estas células pueden eliminarlo de manera tan eficaz como lo harían los linfocitos T atacados por el virus, es más, éstas son capaces de atacar eficazmente a varios mutantes del VIH.
9 Insuficiencia cardíaca
La TG viene a aumentar el abanico terapéutico disponible en la actualidad en la insuficiencia cardiaca, abriendo las puertas a un nuevo tratamiento que tiene como diana a la proteína fosfolamban. Individuos con insuficiencia cardiaca presentan alteraciones en la regulación de esta proteína. La sobre-expresión, mediante un virus adenoasociado, de una forma mutada del gen de la fosfolamban bloquea a la proteína nativa. En estos casos se utilizó un catéter, similar al utilizado en la actualidad para practicar angioplastias, para transportar el virus hasta el lugar de acción.
10 Arterosclerosis
Recientemente se ha abierto la posibilidad de aplicar la TG a patologías como la arteriosclerosis.
La administración, mediante catéteres espaciales, en la arteria poplítea de la extremidad afectada por mal riego sanguíneo de genes que expresaban el factor de crecimiento vascular endotelial, ha sido considerada un éxito parcial. Aunque los resultados iniciales no han sido del todo buenos (ya que tan «sólo» consiguieron evitar la amputación de la pierna gangrenada durante varias semanas), sí consiguieron revascularizar la extremidad.
11 Disfunción eréctil e infertilidad
La sobre-expresión de factores de crecimiento antes de una prostatectomía radical podría ayudar a reparar el nervio cavernoso y, de esta manera, se podría minimizar la disfunción eréctil neuropática y preservar la capacidad de erección. En ratas, la técnica alcanza tasas de éxito de entre el 70 y el 85%. Las técnicas de TG han sido también empleadas para revertir la infertilidad en ratones machos, que se convirtieron en fértiles sin que el gen o el vector lentiviral introducido se transmitiese a su descendencia. Los ratones tratados presentaban dificultad en la formación de células espermáticas debido a ciertas mutaciones en el gen KL2 de sus células de Sertoli.
12 Dolor
Por último, la TG ha realizado incursiones en el campo del dolor. Así, la expresión de forma continuada de preproencefalina en neuronas sensitivas abre las puertas a aplicaciones clínicas en el tratamiento del dolor asociado al cáncer, artritis, angina y neuropatías periféricas. La TG, al ser específica, permite que la liberación de sustancias analgésicas se produzca tan sólo en los lugares de la hiperestimulación, evitando la aparición de efectos secundarios de los narcóticos como la confusión mental y el letargo.
A continuación discutiremos las técnicas de terapia génica empleadas en las diferentes enfermedades humanas así como sus problemas y resultados.
13 Fibrosis quística
Se han utilizado muchos experimentos en los que se usaron cultivos celulares para encontrar un camino eficiente para introducir genes humanos en células sin que sufran reordenamientos u otras alteraciones que puedan afectar a la expresión génica, es decir, que el gen introducido sea estable.
El gen para la fibrosis quística (CF) era un objetivo importante para la terapia génica. In vivo se habían descrito anormalidades en la conductancia en los canales de cloro, y una línea celular CF- expresaba el mismo defecto. Esta línea celular se utilizó en ensayos que intentaban estudiar la actividad del gen CF introducido en la célula. Uno de los vectores que más se han utilizado en la lucha contra la fibrosis quística ha sido el vector retroviral. Un ADNc para el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) era construido por el solapamiento de tres clones ADNc, y un ADNc completo era clonado en un vector retroviral.
Las células CF- eran infectadas por un vector retroviral que llevaba un gen CFTR, y la célula con el provirus integrado eran seleccionadas por su resistencia al G418. Las células expresaban el gen CFTR. Los datos más interesantes procedían de las medidas del grado de funcionamiento de los canales para el cloro. El flujo aniónico de las células en respuesta a una estimulación por la adenilato ciclasa proporciona una conductancia para el cloro semejante. En ausencia de un determinado estimulador de la adenilato ciclasa, el flujo aniónico de las células CF- y de las células CF- que contienen el gen CFTR introducido se pierde. Si se le adiciona este determinado activador de la adenilato ciclasa, el flujo aumenta rápidamente en células CF- con CFTR , pero en las células CF- el flujo permanecía bajo. Se utilizaron técnicas electrofisiológicas para determinar si la conductancia para el cloro influía en ese flujo aniónico. Estos experimentos mostraron que las corrientes de cloro se detectaban únicamente en las células CF- con CFTR. Significativamente, la respuesta de las células CF- con CFTR es comparable con las respuestas traqueales humanas normales y alienta la esperanzas de que la terapia génica para la fibrosis quística , usando vectores retrovirales directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de aerosoles, sea posible.
14 Terapia génica utilizando fibroblastos de la piel
Estas células han sido usadas en pacientes afectados de mucopolisacaridosis, que es una enfermedad hereditaria que se caracteriza por la deficiencia de enzimas lisosomiales.
Los fibroblastos se obtienen fácilmente crecen bien en cultivo, y pueden ser infectadas eficientemente con vectores retrovirales. Por ejemplo, las células de un paciente afectado por la enfermedad de Gaucher (deficiencia de glucocerebrosidasa) eran infectadas con un vector retroviral que contenía un ADNc de la glucocerebrosidasa. Los niveles de enzima en las células infectadas alcanzó el nivel de las células normales. En el caso de la deficiencia de adenosina desaminasa, los fibroblastos de la piel infectados con un retrovirus que llevaba un ADNc de ADA producía más ADA que las células normales. Los investigadores calculan que se necesitan más de 4x10e8 fibroblastos tratados genéticamente para producir efecto terapéutico en pacientes.
15 Terapia génica aplicada a hepatocitos
Un gran número de enfermedades metabólicas hereditarias afectan al hígado, y el transplante de hígado ha sido utilizado para tratar estas enfermedades y otras como son la hipercolesterolemia y hemofilia. Estas técnicas se han desarrollado a partir de aislamiento y cultivo de hepatocitos.
Ejemplos de la utilización de estos hepatocitos es el estudio y tratamiento por terapia génica de la hipercolesterolemia en humanos. Esta es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), y aquellos pacientes que son homocigóticos para la mutación del gen de LDLR generalmente mueren por un ataque al corazón antes de los 20 años.
16 Linfocitos modificados genéticamente
Un sistema de entrega a células de melanomas malignos está siendo utilizado en experimentos clínicos. Los linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs) son linfocitos que se infiltran el tumores sólidos y que pueden matar células tumorales si se administran junto a la interleuquina 2 (IL-2), que es un factor decrecimiento de linfocitos. Cuando los TILs eran aislados de melanomas malignos, estimulados en su crecimiento en un cultivo tisular con IL-2, y se inyectaban de nuevo al paciente, en ocasiones producían la regresión del melanoma.
Para intentar conocer como los TILs trabajan in vivo, es importante conocer cuantos de los TILs transplantados sobreviven y si alcanzan los tumores. Una estrategia que se ha desarrollado para seguir los TILs inyectados al paciente es marcarlos con retrovirus. La primera vez que se hizo este experimento en células humanas genéticamente modificadas se utilizó un vector retroviral que llevaba el gen de resistencia a la neomicina.
17 Deficiencia de adenosina desaminasa (inmuno deficiencia combinada grave)
Se debe a un trastorno autosómico recesivo. Su deficiencia origina una disfunción intensa en las células T y B, que provoca la muerte de los pacientes antes de los dos años de edad por infección masiva. Se comenzó a estudiar su tratamiento por terapia génica en 1.990 para una mutación en el gen adenosina desaminasa. Dos niños de cuatro y nueve años con deficiencia de ADA están recibiendo terapia génica. De los niños se aíslan linfocitos T, a los que se les introduce un gen ADA normal usando un vector retroviral, y son devueltos a los pacientes. Los niños han estado recibiendo células con genes corregidos cada uno o dos meses durante un año y estos niños mostraron mejoras clínicas significativas. Ahora son capaces de iniciar una respuesta inmunitaria y se ha producido una importante decreción del número de infecciones. El niño de menor edad, que ha sido tratado por más tiempo, puede llevar una vida completamente normal. Estos resultados son muy esperanzadores, y si la terapia génica en células ítem de la médula avanza, no será necesario un injerto continuo de células modificadas.
Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace ya más de cuatro años ensayos clínicos de transferencia génica de ADA hacia los linfocitos T periféricos, previamente tratados in vitro. Aunque algunos pacientes experimentaron una notable mejoría clínica e inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los índices de la función inmunitaria.
18 Terapia génica en la cura del cáncer
El diagnóstico del cáncer a nivel molecular permitirá un pronóstico más preciso; pero aún podemos llegar más lejos utilizando una terapia génica que tiene como finalidad la destrucción selectiva de la célula Tumoral. La pérdida del oncosupresor p53 puede ser corregida introduciendo una copia sana en la célula neoplásica; la sobre-expresión del oncogén k-ras también puede suprimirse introduciendo el gen k-ras anti-sentido que inactive su expresión o bloquee sus ARNs.
Los retrovirus permiten introducir genes, potencialmente suicidas, en el seno de un Tumor ya que infectarán e insertarán su ADNc en células en división; los adenovirus, aunque no integren en el huésped pueden permanecer activos el tiempo suficiente para destruir el Tumor. También es posible introducir en el Tumor o en el organismo genes inmunoestimulantes, como la interleuquina (IL2), que potencialmente protege de distintos tipos de cáncer y de sus recidivas.
Existe una gran esperanza para pacientes afectados por alguna enfermedad puedan ser tratados por terapia génica, por la cual, se le sustituye un gen defectivo por un gen normal. Aún así, los obstáculos que supone la terapia génica son muy importantes.
Se necesita mucha información sobre la patología molecular de un desorden genético, antes de que los investigadores puedan decidir si este desorden es factible a la terapia génica, y si es así, también habría que tener en cuenta diferentes asuntos sociales y éticos. El gen en cuestión debe ser clonado y además debe existir una manera segura de introducir el gen en las células.
TERAPIA GÉNICA: Cuestiones económicas y Consecuencias
CUESTIONES ECONÓMICAS
Datos económicos indican que los costes de los primeros años de transplantes cardiacos son unos $ 90.000 por paciente, sería razonable preguntarse si la terapia génica será otra tecnología costosa a medio plazo. Si se emplea en transplantes de médula ósea, en la terapia génica humana será trabajada intensamente y supondría unos considerables costes iniciales. Pero aún cuando nadie asigna un valor económico en el mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes curados, lo más seguro es que algún día la terapia génica costará considerablemente menos que la hospitalización repetitiva por enfermedades como la anemia falciforme o la fibrosis mística. En breve, para pacientes que sufran alguna enfermedad genética causado por el defecto en un gen, la terapia génica se puede convertir en un método de cura bastante costoso.
CONSECUENCIAS DE LA TERAPIA GÉNICA
La modificación del material genético de una célula afecta tanto a la célula como a sus descendientes. Hay un gran debate de los peligros potenciales del uso de un tratamiento que diseña deliberadamente cambios genéticos que son potencialmente propagables.
Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones genéticas de la línea germinal. Se cree que los riesgos de estos tratamientos. Pero, ¿cuáles son estos riesgos?
1 Todas las integraciones cromosómicas, aparte de los cambios homólogos, poseen el potencial de alteración de locis endógenos fortuitos y por lo tanto producir mutagénesis, que puede derivar en oncogénesis. Si realizamos la terapia génica en células somáticas nosotros no transmitiremos los genes manipulados en esas células somáticas a las futuras generaciones pero alteramos la línea genética del individuo. La intervención directa en las células somáticas difiere del tratamiento médico convencional sólo en que aquí hay una clara y directa conexión entre la terapia y la selección genética.
2 En el caso de síndromes causados por locis dominantes el conjunto completo de genes está representado por los individuos afectados. Su éxito reproductivo por lo tanto influye directamente en el tamaño de este conjunto en la siguiente generación. Si los individuos llevan alelos no reproductivos, la frecuencia del gen en la población está mantenida por que ocurran nuevas mutaciones.
3 En las enfermedades genéticas ligadas al sexo, recesivo en la mujer y dominante en el hombre. Como el número de afectados es mucho mayor (todos los machos que lleven el alelo se verán afectados) la influencia del éxito de la terapia en la frecuencia génica será también mayor.
4 La modificación deliberada de la línea germinal tendría efecto sobre la estructura de la población sólo por una transformación genética a gran escala o alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta ventaja selectiva. Un hecho preocupante sería la introducción de resistencia a una enfermedad patógena. Si sólo "los elegidos" son protegidos de la enfermedad podría existir la posibilidad de un gran cambio genético en la población
5 La terapia génica somática, tiene un efecto directo sobre el paciente individual pero alguna transformación génica de la línea germinal puede sólo tener efectos sobre la descendencia aún no nacida. Esto por lo tanto no afectará al paciente que está siendo tratado. Con las posibilidades de investigación de prenatales de la preimplantación tanto como de la donación de esperma y óvulos y adopción es muy difícil ver como la intervención deliberada en la línea germinal puede ser éticamente justificable.
CONCLUSIONES
Aunque en este trabajo hemos dado una visión de la TG sólo en el tratamiento de enfermedades hereditarias, la ingeniería genética desde su inicio se ha utilizado para sintetizar, y en algunos casos liberar, proteínas con fines terapéuticos.
La modificación genética de vegetales y animales permite, no sólo mejorar sus rendimientos o resistencias frente a plagas o inclemencias naturales, sino también la producción de proteínas de interés farmacéutico
Los últimos avances a la hora de perfeccionar las técnicas tanto en el cultivo de células de la piel como de producir vectores estables y fiables para expresar e introducir información genética en estas células hacen suponer que la piel será uno de los más atractivos sistemas para corregir enfermedades mediante terapia génica.
Los TILs son útiles para tratar células tumorales, pero todavía no se ha comprobado el rendimiento que puede sacarse de esta facultad.
Dentro del campo de las aplicaciones de la terapia génica en el hombre, se puede considerar el cáncer como el área más importante y de más rápida expansión.
Si se rompiese el eslabón entre el transplante de médula ósea y la terapia génica, ésta se podría aplicar a un círculo de pacientes más extensos.
Conel desarrollo de la terapia génica, la medicina estará en el unbral de una nueva era para el tratamiento de más de 3.000 desórdenes genéticos que afecten a nuestra especie.
El peligro que supone manejar microorganismos manipulados genéticamente depende de su capacidad para sobrevivir e intercambiar material genético con comunidades de microorganismos autóctonos
Las aplicaciones pueden ser beneficiosas, pero también problemáticas. Algunos expertos ya han señalado la diferencia que existe entre introducir genes nuevos para tratar una enfermedad y alterar el linaje de un individuo, lo cual puede crear graves desórdenes genéticos
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Terapia Génica, Rómulo Aycachi Inga, Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Microbiología y Parasitología Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallos Lambayeque, Setiembre del 2004.
Aplicaciones de la terapia génica, JUANA ROZALÉN, Revista Ambito Farmaceutico, VOL 22 NÚM 10 NOVIEMBRE 2003
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Reflexion Teorica sobre la Influencia de la Terapia Genica
Con el desarrollo de nuevas tecnologías y la aplicación de estas al estudio de la composición fisiológica de nuestra especie, el hombre a abierto una puerta a un sin fin de posibles aplicaciones al conocimiento de nuestra estructura molecular o genética, presentándose su mayor aplicación en el campo de la medicina y el tratamiento de enfermedades complejas o “raras”, que esta el momento la terapia farmacológica tradicional no les daba mayores esperanzas a los pacientes que las padecían que terapias de mantenimiento y trabajo físico, lo que con la posibilidad de la manipulación de genes y su expresión ha venido a convertirse en una posible cura o mejoramiento de los síntomas a través de la terapia génica.
Dentro del campo del tratamiento de las enfermedades complejas, uno de los avances más importantes logrados en las ultimas décadas es el desarrollo de estudios a nivel genético que han permitido entender en gran parte la estructuración y funcionamiento de nuestra fisiología molecular, reconociendo dentro de las aplicaciones observadas la posibilidad de abrir la puerta a terapias alternativas en busca de curas para enfermedades que hasta el momento no tenían tratamientos viables con resultados satisfactorios en la terapia farmacológica convencional, por lo complejo de sus cuadros sintomáticos o porque se presentaban como un caso excepcional para el cual la medicina tradicional parecía no tener el tratamiento adecuado, estas enfermedades corresponden a errores en la estructura o expresión de los genes que en la mayoría de casos presentan malformaciones y/o cuadros aberrantes de total dependencia debido a su incidencia psicomotora por parte de los pacientes afectados, tal es el caso de las enfermedades monogénicas hereditarias; un segundo caso corresponde a algunas enfermedades infecciosas como el sida, que por lo complejo y resistente del virus hace muy difícil el pensar en una vacuna preventiva o una cura definitiva; y un tercer caso es el de errores en los ciclos celulares (producción de proteínas) que dan como resultado diversos tipos de cáncer, es de resaltar que es justamente en este ultimo donde se encuentran la mayor cantidad de estudios y protocolos de tratamiento algunos con muy buenos resultados. En estos tres casos la alternativa a su tratamiento se ha obtenido desde la terapia génica, que como su nombre lo dice, lleva a cabo el tratamiento de la enfermedad a nivel de los genes, es decir, el tratamiento se basa en la modificación del genotipo de las células mediante la introducción de material génico exógeno con el fin de corregir daños o defectos en la expresión o estructura de los genes a través de tres posibles efectos celulares como son, la muerte celular (tumorales), la inactivación de genes patógenos o la anulación de los efectos nocivos de un gen defectuoso al introducir un gen sano; lo que lleva a que su principal ventaja como posible tratamiento este en la sencillez de tratar la enfermedad su origen primordial los ácidos Nucléicos, objetivizando para tal efecto la efectividad de la transferencia, la especificidad al tipo o tipo de células relevantes y la persistencia del material transferido. Las formas de trabajar la terapia génica las podemos clasificar en tres grupos así: de adición génica, supresión génica y corrección génica; La terapia génica requiere para su aplicación el conocimiento de la etiología de la enfermedad y sus bases genéticas, disponer de un modelo animal previo al ensayo clínico en humanos, conseguir un sistema de introducción y diseminación eficaz del material genético y saber controlar los efectos secundarios derivados de éstas.
Algo que se debe entender es que el futuro de la terapia génica aunque es muy prometedor en el manejo de variadas patología, en ningún caso es reemplazar a la medicina farmacológica, sino que más bien se presenta como apoyo a la misma para el tratamiento de patología complejas beneficiando al paciente al ofrecerle tratamientos más complejos y de mejores resultados.
Una discusión que se ha despertado por causa de los tratamientos ofrecidos por la terapia génica, gira en torno a su aplicación en fetos en gestación, ya que algunos sectores de la sociedad considera esta práctica como algo antinatural, por considerar que se está intentando suplantar a Dios en su labor, más cuando se utilizan ciertos procesos parte de ingeniería genética para llevar a cabo modificaciones genéticas diferentes a las meramente terapéuticas, por lo demás se puede decir que aunque la terapia genética no ha ofrecido todos los resultados que se esperaban de ella, el avance que existe en materia de tratamiento básicos a un gran número de enfermedades en bastante significativo y el estudio en muchas otras sigue aumentando.
Aplicaciones de la Terapia Genica
GENÉTICA
Aplicaciones de la terapia génica
JUANA ROZALÉNa, FRANCISCO J. FERNÁNDEZ GÓMEZb, VALENTÍN CEÑAcy JOAQUÍN JORDÁN
aLicenciada en Químicas.bLicenciado en Farmacia.cCatedrático de Farmacología de la UCLM.dProfesor titular de Farmacología de la UCLM.Centro Regional de Investigaciones Biomédicas. Universidad de Castilla-La Mancha.
Terapia génica (TG) es la parte de la terapéutica que utiliza materialgenético en el tratamiento de enfermedades; intenta modular la funcióncelular, pudiendo corregir la deficiencia causada por la pérdida o alteraciónde un gen al modificar la expresión de proteínas. Así, secuenciascodificadoras de proteínas, sondas antisentido, ADN triples y ribozomaspueden ser considerados los fármacos de la TG. Los problemas másimportantes con los que se encuentra este conjunto de técnicas son dedistribución de estos «fármacos», es decir, la transferencia de este materiala las células diana.142 OFFARM VOL 22 NÚM 10 NOVIEMBRE 2003ÁMBITO FARMACÉUTICOdiana en germinal o somática; delas estrategias ex vivo e in vivo, y delas aproximaciones en aditiva ysustitutiva. Así pues, cuando laTG es aplicada sobre células germinales, espermatozoides u óvulos,origina un cambio permanente entodo el organismo y en los futurosdescendientes del individuo. Suapl i c a c i ón en s e r e s humano s e sfuente de gran controversia debidoa los problemas éticos que supone.Por el contrario, el uso de la TGen células somáticas o no germinales sólo afecta al individuo tratadoy las modificaciones no son heredadas por su descendencia. Tanto en la estrategia ex vivo,donde las células diana son extraí-das y reimplantadas en el mismopaciente tras haber sido modificadas en el laboratorio, o en la invivo, donde la administración delgen corrector se realiza directamente al paciente, la TG utilizados aproximaciones: aditiva y sustitutiva. En la TG aditiva, másu t i l i z a d a y a v a n z a d a , e l g e n e sincorporado con sus propios elementos de regulación, mientrasque en la TG sustitutiva el gen esmantenido en su contexto natural,sometido a sus controles normalesde e xpr e s i ón. La TG adi t i v a v ecomprometida su relativa alta eficacia por la complejidad de dotaral gen terapéutico de un controlade cuado de e xpr e s i ón y po r e lriesgo de que la recombinación delmaterial genético dé resultados nod e s e a d o s c o m o l a m u t a g é n e s i sinsercional.En la elección de la célula blancode l a t r ans f e r enc i a géni c a debetenerse en cuenta la finalidad deltratamiento, desde la corrección deun defecto en una población general celular (como en la talasemia)hasta la producción, a partir de lascélulas transducidas, de una prote-ína de secreción para la correcciónde un defecto sistémico, como enlas hemofilias. Entre las célulasmás frecuentemente utilizadas destacan los fibroblastos de la piel ylos linfocitos infiltrantes en tejidosy, como órgano diana, el hígado.Hasta el presente se han descritounas 4.000 enfermedades hereditarias, muchas de las cuales no estántodavía caracterizadas molecularmente. En ellas se encuentra ung r a n n ú m e r o d e e n f e r m e d a d e sm o n o g é n i c a s c a u s a d a s p o r e ldefecto de un solo gen cuyo tipode herencia sigue las pautas mendelianas. Es en este tipo de enfermedades donde la TG supone la vía másesperanzadora al éxito, ya sea curando el gen defectuoso en el tejidoq u e n o r m a l m e n t e l o e x p r e s a osuministrando a un tejido conveniente un gen funcional que desempeñe las funciones del defectuosos i n e l imi n a r l o , c omo y a h emo sexplicado anteriormente (tabla 2). A f i n a l e s d e l a d é c a d a d e l o sochenta, se consideraban alteraciones idóneas para el tratamientogénico de la enfermedad de LeschNyhan, provocada por la ausenciade la enzima hipoxantina-guaninafosforribosil transferasa, e inmunodeficiencias como la PNP, provocadas por la carencia de una purinanucleósido fosforilasa o la inmunod e f i c i e n c i a c o m b i n a d a g r a v e o«niños burbuja», que presentanuna falta de la enzima adenosinadesaminasa. Actualmente, se ha ampliado elnúmero de afecciones a ser tratadasmediante TG. Tan sólo las mutac i o n e s p u n t u a l e s e n e l g e n omamitocondrial son causa de más de50 patologías en humanos, entrelas que resaltamos algunas encefal omi opa t í a s , a c ido s i s l á c t i c a , l aneuropatía óptica hereditaria deLeber, miopatía, debilidad neurogénica de músculo, ataxia, retinitispigmentosa y un largo etcétera. Enellas, basta la expresión leve de laforma correcta de los productosgénicos alterados para corregir lapatología. Unos valores ligeramente superiores de éstos no parecentener consecuencias negativas. Sirvan como ejemplo las afeccionesque a continuación detallamos.Inmunodeficiencia combinadagraveEn la inmunodeficiencia combinada grave se ha descrito un defectoen el gen que codifica una parte deun receptor celular que envía lasseñales a los progenitores de lascélulas T y NK. Sin este gen lascélulas no se desarrollan, no creceny tampoco proliferan, lo que haceque los pacientes se encuentreni n d e f e n s o s f r e n t e a l a má s l e v ei n f e c c i ó n , v i é n d o s e a b o c a d o s avivir en el interior de una burbujaestéril («niños burbuja») a la esper a d e u n t r a s p l a n t e d e mé d u l aósea. La corrección génica de unpequeño número de células permite recuperar toda su fuerza y repoblar toda la parte del órgano quefalla. En 1990, se aprobó en Estados Unidos el primer ensayo clínico de auténtica TG. Se trataba deintroducir el gen que codifica parala enzima adenosina desaminasa enniños que presentaban una inmunode f i c i enc i a c ombinada gr a v e .Un a ñ o d e s p u é s , s e a u t o r i z ó e lmismo tipo de ensayo en Italia, yen 1995 los dos grupos de investigación publicaban los resultadosd e s u e x p e r i m e n t a c i ó n c l í n i c aponiendo de manifiesto la eficaciade la técnica de TG ex vivo en los«niños burbuja». A p r i n c i p i o s d e l a ñ o 2 0 0 0 ,investigadores franceses pusieron apunto con éxito un método de TGq u e t r a t a l a i nmu n o d e f i c i e n c i acombinada grave X-1 en el hombre. Dos lactantes de 8 y 11 mesesrecibieron una copia normal delgen defectuoso y, tras once mesesdesde su aplicación, los bebés presentaron un sistema inmunitarionormal y sin efectos secundarios.En este caso, los investigadoresrecolectaron médula ósea de losp a c i e n t e s c o n e l f i n d e e x t r a e rcélulas progenitoras hematopoyé-ticas e infectarlas con un retrovirusportador del gen de reemplazo.Transcurridos tres días de infección repetida, los científicos trasplantaron las nuevas células a lospacientes y, en tan sólo 15 días, sedetectaron nuevas células portadoras de la versión correcta del gen yu n i m p o r t a n t e c r e c i m i e n t o d ecélulas inmunitarias plenamentefuncionales y diversificadas. Hoydía, se mantienen abiertas variaslíneas, en todas ellas el gen a transduc i r s igue s i endo l a adeno s inadesaminasa y el vector utilizado, losretrovirus. Las diferencias estribanen el tipo de célula diana, así comoen las vías de administración.E l d o m i n i o a d q u i r i d o e n l o strasplantes de médula ósea y lacapacidad que tienen las célulasprimordiales hematopoyéticas parareconstituir totalmente la médulaVOL 22 NÚM 10 NOVIEMBRE 2003 OFFARM 143GENÉTICAósea hacen del sistema hematopoyético un candidato idóneo para elt r a t ami e n t o g é n i c o e n a l g u n a shemoglobinopatías (talasemias),deficiencias de adhesión leucocitar i a y enf e rmedade s de depó s i t ol i s o s oma l ( enf e rmedad de Gau -c h e r ) . L a s h e m o g l o b i n o p a t í a srepresentan uno de los trastornosgenéticos más frecuente en humanos. Una aproximación es la expresión regulada del gen de la globina, para lo que se ha utilizado vectores retrovirales. La enfermedadd e Ga u c h e r e s u n a e n f e rme d a dautosómica recesiva, producida porel derivado proteico de un gen quecodifica la enzima glucocerebrosidasa. Aunque el trasplante alogé-nico de médula ósea ha corregidola enfermedad en algunos pacientes, en la actualidad se están llevando a cabo estudios de trasferencia génica retroviral del gen de lag l u c o c e r e b r o s i d a s a e n c é l u l a sm a d r e d e r a t ó n , s e g u i d a d e l aexpresión proteica en macrófagosdiferenciados a partir de célulasmadre transducidas.HemofiliaLa TG está resultando también eficaz en casos de hemofilia «A» y«B» donde se encuentran alteradoslos factores coagulantes VIII y IX,respectivamente. En ellas se hanrealizado aproximaciones utilizandoel transgén de estos factores y vectores retroviales, adenovirus, virusadenoasociados y ADN desnudoadministrados por vías comunescomo la subcutánea, intramuscular,intrahepática, intraperitoneal, ointravenosa. Los vectores actúan como un liberador de los factores a las célulasmus cul a r e s de l pa c i ent e , dondeproducirán continuamente este factor. Valores equilibrados de éstos enel flujo sanguíneo reducirán sustancialmente los episodios de hemorragias espontáneas y la necesaria infus i ó n d e e s t a s p r o t e í n a s e n l o spacientes de este tipo de hemofilia.Fibrosis quísticaEn la fibrosis quística se ha observado un defecto en el gen que codifica para el canal de cloro conocidoc omo CFTR, que r e sul t a en untransporte anormal de electrólitosen las glándulas exocrinas y conduce a una enfermedad crónica obstructora de los pulmones, insufic i e n c i a p a n c r e á t i c a e x o c r i n a yaumento de la cantidad de electró-litos en el sudor. Utilizando comotransgén el gen de CFTR y comocélulas diana las células del epiteliodel tracto respiratorio, se han realizado estudios utilizando liposomasy adenovirus como vectores. Losriesgos de toxicidad parecen descartados en los primeros intentos ybasta algo tan sencillo como uninhalador para conseguir la expresión del gen y aliviar en un 30%los síntomas de la enfermedad.Distrofia muscular DuchenneEn un avance significativo haciaun tratamiento para la distrofiamuscular de Duchenne (DMD),investigadores han usado TG paraproteger músculos respiratoriosvitales en ratones con la enfermedad, debido a que la mayor causade muerte en la DMD es el deter i o r o d e l d i a f r a g m a . L a n u e v ainvestigación ha demostrado porpr ime r a v e z c ómo e l di a f r agmapuede ser rescatado por medio dela inyección intravenosa con el gende la distrofina, que es defectuosoen las personas con DMD. Después del tratamiento, el músculode l di a f r agma de l r a t ón mo s t r óuna expresión estable del gen de ladistrofina durante seis meses.CáncerEn el cáncer las líneas de investigación, tanto preclínicas como clí-GENÉTICA144 OFFARM VOL 22 NÚM 10 NOVIEMBRE 2003Tabla 1. Protocolos de terapia génica aprobados por el RAC en Estados UnidosEnfermedad Gen suministrado Tejido diana Vector Enfermedades hereditarias Enfisema pulmonar Alfa-1-antitripsina Tracto respiratorio Liposomas Fibrosis quística CFTR Tracto respiratorio – AdenovirusAAV– Liposomas Hipercolesterolemia familiar Receptor LMW de lipoproteínas Hepatocitos Retrovirus Inmunodeficiencia combinada Adenosina desaminasa – Linfocitos Retrovirus grave («niños burbuja») – Células progenitoras hematopoyéticas Enfermedades adquiridas Sida (infección por VIH) – Ribozimas Linfocitos Retrovirus – ARN antisentido– Anticuerpos Restenosis (arterias periféricas) Factor tumoral de angiogénesis Células endoteliales Plásmidos Cáncer – Genes supresores de tumores – Pulmón – Retrovirus – HTK-ganciclovir – Hígado – Adenovirus– Factor de necrosis tumoral – Cerebro – Retrovirus– Interferón (gamma) – TIL – Retrovirus– Melanoma – Retrovirus nicas dentro de la TG, pueden seragrupadas en varias estrategias: – D e s t r u c c i ó n d e l a s c é l u l a stumorales mediante la expresiónd e p r o d u c t o s t ó x i c o s , o , e n s udefecto, enzimas capaces de activarprofármacos, como puede ser porl a s o b r e e x p r e s i ó n d e l a e n z imatiroxina cinasa que transforma unp r o f á rma c o , e l a c i c l o v i r, e n u nveneno.– Fortalecer y estimular la protección natural del sistema inmunitario contra las células anormalesincrementando el carácter extrañode estas células, potenciando losmecanismos del sistema inmunitario o modificando las células cancerígenas para hacerlas más susceptibles a su destrucción. – Cambi o de l f eno t ipo de l a scélulas cancerígenas, bien inhibiendo la expresión de oncogenes oaumentando la de genes supresoresde tumores, como el p53 que aparece mutado en un alto porcentajed e t u m o r e s , o i n t r o d u c i e n d o«genes suicidas» en células tumorales.– Protección de las células normales de los efectos de la quimioterapia o radioterapia. – Incremento de la cantidad ycitotoxicidad específica de los linfocitos que reaccionan con las células tumorales.L a s p r ime r a s a p r o x ima c i o n e sutilizaban el marcaje de linfocitosde infiltración tumoral para seguirel progreso del tratamiento contrael melanoma maligno. En 1990, seobtuvo la aprobación definitivap a r a u n a a p l i c a c i ó n d e T G apacientes con casos avanzados demelanoma basada en experimentosex vivo con linfocitos de infiltración tumoral (TIL) procedentes delos tumores de pacientes con melanoma. Los TIL fueron introducidosen una solución de interleucina-2,una sustancia natural que potenciasu efecto destructor, y posteriormente expuestos a retrovirus quecodificaban para el factor de necros i s t u m o r a l , u n a p r o t e í n a q u einterfiere con el suministro de sangre al tumor y debilita las célulastumorales. Los TIL activados sehospedarían en los tumores atacando las células cancerosas y, a la vez,l ibe r ando e l f a c t o r ant i tumo r a lpara ayudar a exterminarlos. Sinembargo, esta aproximación presenta problemas debido a que losl i n f o c i t o s m o d i f i c a d o s p u e d e nqueda r a t r apado s en e l hígado ,bazo y pulmones, y la expresión noregulada en estos órganos del factor de necrosis tumoral puede originar procesos tóxicos secundarios.Alteraciones hepáticasA pesar de los problemas técnicos,existen protocolos clínicos aprobados para la transferencia ex vivo degenes al hígado, para el tratamient o d e l a i n s u f i c i e n c i a h e p á t i c aaguda e hipercolesterolemia familiar (tabla 1). Los experimentoscon ratones transgénicos, bioquí-mica y fenotípicamente modificados han permitido evaluar la eficacia terapéutica de la transferenciagénica somática de vectores adenovirales de la ornitina transcarbamilasa (OTC), beta-galactosidasa yalfa1-antitripsina humana. Una delas vías para restituir la funcionalidad del hígado cirrótico se enfocaen la degradación del exceso dea cumul a c i ón de pr o t e ína s de l amatriz extracelular, principalmente colágena tipo I en el parénquima hepático. La metaloproteasa dematriz-8 o colagenasa de neutrófilos de humano es una buena candidata para ser sobreexpresada. Otraaproximación, en hígados cirróticos, la constituye el gen del activador del plasminógeno urocinasahumano modificado. Su inserciónme d i a n t e u n v e c t o r a d e n o v i r a linduce la degradación del excesode matriz extracelular y estimulal a pr o l i f e r a c i ón de hepa t o c i t o s ,l o g r a n d o u n r á p i d o r e s t a b l e c i -mi ent o de l a func i ona l idad de lhígado.DiabetesLa TG mantiene abiertas dos líneas de investigación en pacientescon diabetes tipo 1, caracterizadapor una pérdida completa de lascélulas betapancreáticas. Mientrasla primera se basa en la modificación de la respuesta anómala delsistema inmunitario, la segundaint ent a aument a r e l núme r o decélulas capaces de secretar insulin a . E n t r e l a s v í a s d e a c t u a c i ó nsobre la respuesta autoinmunitariadestacan: – Inhibición de moléculas implicadas en el desarrollo de la diabetes tipo 1 como interleucina 1beta,f a c t o r de ne c r o s i s tumo r a l a l f a ,interferón gamma, interleucina 6y óxido nítrico. – Estimular la expresión de interleucina 4 con el fin de prevenir elproceso de inflamación previo a ladestrucción de las células beta. – Inhibición de la interacción demoléculas Fas/Fas-L.– Producción local, en célulasbeta genéticamente modificadas,de moléculas anti-CD40-ligando,una proteína que desempeña unpapel clave en la activación de loslinfocitos T. Con el fin de aumentar el número de células beta, la TG ha cent r a d o s u s e s f u e r z o s e n g e n e r a rcélulas no-beta capaces de secretarinsulina en respuesta a las concentraciones de glucosa. El tipo celular donde se han obtenido resultad o s m á s i n t e r e s a n t e s y q u e h agenerado mayores expectativas esel hepatocito. Los hepatocitos presentan la capacidad de captar laconcentración extracelular de gluc o s a , y a que c ompa r t en c on l a scélulas beta algunos de los component e s na tur a l e s de l s i s t ema dedetección de glucosa, como la glucocinasa y GLUT-2. Los hepatocit o s modi f i c ado s s on c apa c e s deproducir insulina con la actividadbiológica y funcional similar a laGENÉTICA146 OFFARM VOL 22 NÚM 10 NOVIEMBRE 2003La TG mantiene abiertas dos líneas de investigación enpacientes con diabetestipo 1, caracterizada por una pérdidacompleta de las célulasbetapancreáticasde la molécula producida por elpáncreas. No obstante, debido aque las células del hígado present a n d i f e r e n t e s e n s i b i l i d a d a l aglucosa que el páncreas, las ciné-ticas (los ascensos y descensos) deproducción de la insulina obtenidas son muy diferentes a las de lainsulina nativa producida por elpáncreas, y el control de la glucosa en sangre no resulta óptimo.La introducción del gen PDX-1,implicado en las primeras fasesd e f o r m a c i ó n y d e s a r r o l l o d e lp á n c r e a s , y e n e l c o n t r o l d e l aexpresión del gen de la insulinaen células beta maduras, ha resultado suficiente para que el hígadode los ratones produzca insulina,lo que ha permitido un descensode las concentraciones de glucosade los animales a los que se lesh a b í a i n d u c i d o l a d i a b e t e sm e d i a n t e e l a g e n t e q u í m i c oestreptozotocina. Una segunda aproximación es lamodificación de hepatocitos paraque pierdan sus características yadquieran propiedades de las células beta. Así, en células de hígadode animales de experimentación enl a s que s e han int r oduc ido do sgenes (Neurod y Btc), se ha observ ado que en una pr opo r c i ón dee l l a s apa r e c e una t r a s f o rma c i ónque inducía la neogénesis de islotes, produciéndose no sólo insulina, sino el resto de las hormonas(glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático). Además, las o b r e e x p r e s i ó n d e g l u c o c i n a s a ,esencial en el sistema sensor deglucosa, tanto de la célula betacomo en el hígado, modificó lascaracterísticas propias del hígado yadquirió las de la célula beta.EnfermedadesneurodegenerativasSe han realizado también aproximaciones de TG en el tratamientode la enfermedad de Alzheimer enhumanos. En cultivos primariosde neuronas piramidales de hipocampo de rata se ha sobreexpresado la proteína calbindina D28K,obteniéndose altos rendimientos.Esta proteína es capaz de unirse alion calcio modulando sus concent r a c i o n e s c i t o p l a s m á t i c a s . L as obr e e xpr e s i ón de e s t a pr o t e ínaconfirió protección a los cultivosf r e n t e a e s t í m u l o s c i t o t ó x i c o scomo el fragmento 25-35 del péptido betaamiloide. También se haanalizado a pacientes en las prime r a s e t apa s de l a enf e rmedad,c o n l a imp l a n t a c i ó n d e c é l u l a scutáneas a las que previamente seles ha introducido el gen del fact o r de c r e c imi ent o neur o l ógi c o(NGF) que ha mostrado resultados positivos en el deterioro cerebral en monos viejos.Otras patologías como la enfermedad de Parkinson, en la que larelación con los factores genéticose s me n o s c l a r a , r e p r e s e n t a n u nmayor desafío. En esta enfermed a d , l a T G h a s i d o l l a m a d a e l«tercer paso», tras la terapia sustit u t i v a c o n l a l e v o d o p a y l o simplantes de células dopaminérgicas. Así, las células hiperactivasdel núcleo subtalámico son consideradas como células diana para lainserción del gen de la descarboxilasa glutámica ácida (GAD), responsable de la producción del neurotransmisor inhibitorio GABA,obteniéndose como resultado unfuncionamiento más normal de laactividad de la red cerebral. También se han realizado aproximaciones de TG ex vivo, con trasplantes decélulas capaces de producir dopamina o de secretar factores de crecimi ent o o neur o t r o f ina s (BDNF,GDNF) que actúan como agentesneurotróficos, activando rutas desupervivencia celular en las neuronas afectadas.GENÉTICA148 OFFARM VOL 22 NÚM 10 NOVIEMBRE 2003Tabla 2. Enfermedades hereditarias que pueden ser consideradas como primeras candidatas a ser tratadas por mediode la terapia génicaEnfermedad Producto normal del gen defectuoso Células a modificar por la TG Inmunodeficiencia Enzima adenosin desaminasa (ADA) Células de la médula ósea o linfocitos T combinada grave (SCID) (niños burbuja) Hemoglobinopatías b-globina de la hemoglobina Células de la médula ósea (talasemias) Hemofilia A Factor VIII de coagulación Células del hígado o fibroblastos Hemofilia B Factor IX de coagulación Células del hígado o fibroblastos Hipercolesterolemia Receptor del hígado para lipoproteínas Células del hígado familiar de baja densidad (LDL) Enfisema hereditario a-1-antitripsina (producto hepático que protege Células del pulmón o del hígado los pulmones de la degradación enzimática) Fibrosis quística Producto del gen CFTR que mantiene libre Células del pulmón de mucus los tubos aéreos de los pulmones Distrofia muscular Distrofina (componente estructural del músculo) Células musculares de Duchenne En la enfermedad de Parkinson, la TG ha sido llamada el «tercer paso», tras la terapia sustitutivacon la levodopa y los implantes decélulas dopaminérgicasUtilizando un virus de inmunodeficiencia felino sobre un modeloanimal de una enfermedad lisosoma l humana , l a enf e rmedad deSly, con déficit de enzima betaglucuronidasa que cursa con deterioro neurológico progresivo, presentó, por primera vez en este tipode investigaciones, no sólo la prevención del progreso neurológico,sino también la restauración de lascapacidades previas mentales delos animales.C o m o ú l t i m o e j e m p l o d e l a senfermedades neurodegenerativasen las que se han llevado a cabodiversas aproximaciones de TG,citaremos las ataxias, en las que seha utilizado como vector un VIHatenuado capaz de alcanzar los ganglios dorsales medulares, una de lasáreas más afectadas en la ataxia deFriedreich. Se ha planteado el usode moléculas, como el factor decrecimiento insulínico-1 (IGF-I),q u e r e t r a s e n l a m u e r t e c e l u l a robservada, planteándose la posibilidad de la regeneración neuronalmediante el uso de células madre.CegueraSe han realizado estudios en untipo de ceguera total, acompañadade degeneración de la retina, quese relaciona con mutaciones en elgen RPE95. En modelos experimentales, la administración directa en la retina de un virus portadord e l g e n f u n c i o n a l e s c a p a z d eimpedir la degeneración y permiteque la actividad eléctrica de estaestructura ocular sea comparable al a q u e s e o b s e r v a e n a n i m a l e ssanos. Los resultados de este estudio constituyen el primer éxitop a r a p r e v e n i r l a c e g u e r a e n u nmamífero y tienen una importancia adicional, si consideramos quelas mutaciones del gen RPE95 seo b s e r v a n e n e l h u m a n o e n l aceguera congénita conocida comoamaurosis de Leber. Por otro lado,la manipulación genética de células de la córnea ex vivo puede ser,en el futuro, una solución frente ala incompatibilidad y el rechazoobservado en algunos trasplantesde córnea. Hasta ahora, los experimentos realizados en animales hansido un éxito. VOL 22 NÚM 10 NOVIEMBRE 2003 OFFARM 149Sida Se han realizado aproximaciones,tanto in vivo como ex vivo, en elsida, mediante el empleo de vectores retrovirales portadores de genesde la cápside o la envoltura delVIH, como la glicoproteína 120,siendo los linfocitos T las célulasdiana. Los glóbulos blancos modificados reconocen las células infectadas por el VIH y las eliminan,tanto en las primeras etapas de lainfección como al cabo de largostratamientos antivirales. En lospr ime r o s ens a y o s c l íni c o s e s t a sc é l u l a s p u e d e n e l i m i n a r l o d emanera tan eficaz como lo haríanl o s l inf o c i t o s T a t a c ado s po r e lvirus, es más, éstas son capaces deatacar eficazmente a varios mutantes del VIH.Insuficiencia cardíaca La TG viene a aumentar el abanicoterapéutico disponible en la actualidad en la insuficiencia cardíaca,abriendo las puertas a un nuevotratamiento que tiene como dianaa la proteína fosfolamban. Individuo s c on insuf i c i enc i a c a rdí a c apresentan alteraciones en la regulación de esta proteína. La sobreexpresión, mediante un virus adenoasociado, de una forma mutada delgen de la fosfolamban bloquea a laproteína nativa. En estos casos seutilizó un catéter, similar al utilizado en la actualidad para practicar angioplastias, para transportarel virus hasta el lugar de acción. ArterosclerosisRe c i ent ement e s e ha abi e r t o l ap o s i b i l i d a d d e a p l i c a r l a TG apatologías como la arteriosclerosis.La administración, mediante caté-teres espaciales, en la arteria poplí-tea de la extremidad afectada pormal riego sanguíneo de genes queexpresaban el factor de crecimiento vascular endotelial, ha sido considerada un éxito parcial. Aunquelos resultados iniciales no han sidodel todo buenos (ya que tan «sólo»consiguieron evitar la amputaciónde la pierna gangrenada durantevarias semanas), sí consiguieronrevascularizar la extremidad.Disfunción eréctil e infertilidadLa sobreexpresión de factores de crecimiento antes de una prostatectomía radical podría ayudar a repararel nervio cavernoso y, de esta manera, se podría minimizar la disfunción eréctil neuropática y preservarla capacidad de erección. En ratas, latécnica alcanza tasas de éxito deentre el 70 y el 85%. Las técnicasde TG han sido también empleadaspara revertir la infertilidad en ratones machos, que se convirtieron enfértiles sin que el gen o el vectorlentiviral introducido se transmitiese a su descendencia. Los ratonestratados presentaban dificultad en laformación de células espermáticasdebido a ciertas mutaciones en elgen KL2 de sus células de Sertoli.DolorPo r úl t imo , l a TG ha r e a l i z adoincursiones en el campo del dolor.Así, la expresión de forma continuada de preproencefalina en neuronassensitivas abre las puertas a aplicaciones clínicas en el tratamiento deldolor asociado al cáncer, artritis,angina y neuropatías periféricas. LaTG, al ser específica, permite que laliberación de sustancias analgésicasse produzca tan sólo en los lugaresde la hiperestimulación, evitando laaparición de efectos secundarios delos narcóticos como la confusiónmental y el letargo.Aunque en este trabajo hemosdado una visión de la TG sólo en elLa TG viene a aumentarel abanico terapéuticodisponible en la actualidad en la insuficiencia cardíaca,abriendo las puertas a un nuevo tratamientoque tiene como diana a la proteína fosfolambanGENÉTICA150 OFFARM tratamiento de enfermedades hereditarias, la ingenieríagenética desde su inicio se ha utilizado para sintetizar,y en algunos casos liberar, proteínas con fines terapéuticos. La modificación genética de vegetales y animalespermite, no sólo mejorar sus rendimientos o resistencias frente a plagas o inclemencias naturales, sino también la producción de proteínas de interés farmacéutico. Así, los animales transgénicos constituyen unaalternativa tremendamente interesante para la industria farmacéutica. Las granjas transgénicas farmacéuticas empiezan a ser realidad y las principales compañíasdel mercado biotecnológico ya han puesto en marcha,de forma experimental, la obtención de proteínas forá-neas (alfa1-antitripsina, fibrinógeno, lipasas BGL, lact o f e r r ina ) de l a l e che de r ebaño s t r ansgéni c o s , ycomienzan a ser realidad las patatas transgénicas queinmunizan contra el cólera o diarreas bacterianas, y elarroz, capaz de producir provitamina A, con la que sepretende evitar los problemas de ceguera asociados adietas basadas en este cereal. Este artículo nos ha dado una idea global de cómo laTG se erige en la actualidad farmacológica como una delas formas más prometedoras de terapéutica. Si bien laTG ha abierto nuevas perspectivas al tratamiento demuchas enfermedades, ésta no es una técnica generalizable o la panacea para todas las enfermedades, por loque tendrá que limitarse, ya que el éxito de su aplicación no reside en la técnica, sino en la enfermedadmisma.